ELISA試劑盒常見問題解答

TOP1：標(biāo)曲顯色過強(qiáng)無明顯梯度

1、主要懷疑點(diǎn)：洗板不充分：

1.1、機(jī)器洗版：確保機(jī)器設(shè)置的針頭能吸干孔中液體，并且加液針頭能加液大于350ul，加液針頭沒有被異物或者結(jié)晶鹽堵住。

1.2、手動洗板，嚴(yán)格按照步驟，使用干凈滅菌的槍頭和加樣槽，使用無氧化劑的吸水紙。加350ul洗液，靜置90秒，在吸水紙上拍干孔中液體后再加入下一步洗液或者試劑。

1.3、特別注意，在加入TMB前的洗板步驟極其重要，殘留的HRP酶會直接導(dǎo)致TMB顯色。

2、次要懷疑點(diǎn)：

2.1、TMB 已經(jīng)污染，檢測TMB是否透明無色，如果偏藍(lán)就是污染了。

2.2、檢查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是雙蒸水，三蒸水或無離子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等過渡金屬，以及HClO都會氧化TMB。

2.3、酶標(biāo)板受潮，長霉，或者試劑過期。

2.4、環(huán)境污染，空氣中有導(dǎo)致顯色的物質(zhì)或者粉塵。

Top2：顯色較弱或不顯色，沒有說明書提供的數(shù)據(jù)陽性強(qiáng)

可能原因分析：

1、檢查標(biāo)準(zhǔn)品是否受潮或者拿錯

2、檢查試劑是否按照說明書中要求的保存條件保存，特別是濃縮檢測抗體和濃縮SABC， 如果放在-20度，融化后會嚴(yán)重影響其活性。

3、移液器是否校準(zhǔn)，可以用去離子水較準(zhǔn)移液器，1000ul=1.0g 100ul=0.1g 10ul=10mg

4、37度培養(yǎng)箱是否校準(zhǔn)溫度（建議用水銀溫度計放入水杯中，平衡12小時以上進(jìn)行測量）。

5、SABC工作液和TMB在孵育前進(jìn)行37度平衡半小時。

6、未嚴(yán)格按照說明書紙質(zhì)版提供的方法操作。

7、試劑盒過期。

Top3：復(fù)孔做的不好，CV值差異大

可能原因分析：

1、復(fù)孔OD450數(shù)值在0.5-2.5之間計算的偏差相對較小，小于0.5會由于操作誤差導(dǎo)致計算的CV值偏高，復(fù)孔樣品數(shù)量在5-10個最佳。

2、操作時按照標(biāo)準(zhǔn)動作進(jìn)行加樣，比如要求槍頭不能碰觸到孔壁內(nèi)側(cè)和底面，槍頭尖部的殘留液體可以觸碰到液面，使之流入樣品孔。

3、加樣盡量快速準(zhǔn)確，不要產(chǎn)生氣泡。

4、樣品需要做預(yù)實驗，使用不同濃度進(jìn)行測試，找到最佳稀釋比。錯誤的稀釋比會導(dǎo)致復(fù)孔誤差大

Top4：顯色太快，背景小于0.2，但是樣品沒有陽性。試劑盒工作正常，但是樣品沒有陽性。

可能原因分析：

1、樣品是否保存妥當(dāng)。蛋白容易降解，最好保存在-80℃，或者新鮮樣品立即檢測。

2、樣品含有的基質(zhì)影響抗原抗體結(jié)合，導(dǎo)致沒有陽性。需要適當(dāng)稀釋樣品 1/5，1/10，1/100，1/1000來摸索最佳檢測稀釋比，稀釋液稀釋樣品后會消弱基質(zhì)效應(yīng)，陽性就會升高。

3、部分試劑盒要求4度過夜孵育樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，如果樣品稀釋后還是檢測不到陽性，建議4度16小時孵育標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，其它步驟在按照說明書提供的溫度和時間進(jìn)行操作。

4、如果是特殊的樣品，請通過郵件與我們技術(shù)支持進(jìn)行聯(lián)系。

TOP5：稀釋過的樣本OD 值比沒有稀釋的樣本值高些

1、血清有基質(zhì)效應(yīng)，會導(dǎo)致試劑盒回收率下降。所以用原液檢測數(shù)值會低于稀釋后的數(shù)據(jù)。

2、FineTest®ELISA試劑盒提供的稀釋液有抗基質(zhì)成分，說明書要求樣品至少稀釋1倍以上

3、血清的基質(zhì)的一類異嗜性抗體或者溶血后的物質(zhì)，這些物質(zhì)會封閉捕獲抗體，導(dǎo)致抗體無法結(jié)合樣品中的蛋白，當(dāng)稀釋后 這類物質(zhì)效應(yīng)下降，回收率就升高。

Top6：標(biāo)曲方程選擇問題

一般我們選擇曲線平滑上升或者下降，所有點(diǎn)都在曲線上，R值接近于1的方程