細胞爬片必備技能

細胞爬片就是讓玻片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在玻片上生長。主要用于組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等。

細胞爬片的準(zhǔn)備

1蓋玻片的選擇：

爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細胞爬片（價格比較昂貴）但是細胞貼壁牢固，拍出照片效果好；

2爬片的剪裁：

可根據(jù)自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標(biāo)的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；

3爬片的使用前處理：

將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍（個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干，備用。烤干后可放入超凈臺中。

4多聚賴氨酸的使用：

很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做后續(xù)的免疫細胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。

細胞爬片的操作

1.胰酶消化細胞后計數(shù)重懸細胞于完全培養(yǎng)基中。

2.加細胞前，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。(整個過程注意無菌操作)

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度接入培養(yǎng)板內(nèi)即可。

4.待細胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。

5.按照實驗設(shè)計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數(shù)量的爬片取出時應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞爬片的固定

另外在保存細胞爬片的時候，一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實驗時取片。

細胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當(dāng)然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。

然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。

常用的固定液

1

冷丙酮

——可用于一般的免疫組化染色。

——將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發(fā)）

——固定10分鐘，取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

2

多聚甲醛(常用4%)

——可用于免疫電鏡、免疫熒光以及TUNEL染色。

——主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等

——室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

3

95％乙醇

——可用于免疫組化。

——優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存較好。缺點：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。

——室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

4

甲醛(福爾馬林)

——應(yīng)用廣泛。

——優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果

——室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存。

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