Step 1. 制備瓊脂糖微球
按照一定的瓊脂糖濃度通過加熱進行溶解(一般為4%或6%,相對較小的濃度制備的微球孔徑較大),攪拌后得到均勻的水相溶液。溫度越高,瓊脂糖的粘度就越低。
不同濃度的瓊脂糖黏度不一樣,一般來說濃度越大粘度越高,需要溶解的時間越長;在相同的加熱時間上,一般來說濃度越大所形成的微粒粒徑也越大。
加熱時間的長短也會對后續成球造成一定影響,如果時間過短,那么瓊脂糖并未完全溶解或者是黏度較大,則會形成較大顆粒,且分散系數也不理想;
如果時間過長,則因在高溫下瓊脂糖可能會發生一定程度的水解,分子量下降,黏度降低,此時有利于在分散相中形成較為均勻的微球。但是如果時間過長,瓊脂糖鏈變得過短,則會對球形度產生影響,同時也會影響機械強度。
Step 2. 制備分散相
將Span 80溶解在有機溶劑(可選種類很多,推薦用液體石蠟等)中,加熱到80℃。
Step 3. 乳化
將Step 1中的瓊脂糖溶液導入Step 2中的分散相,不斷攪拌,乳化20min左右。
如果乳化劑用量不足,則會造成威力,球形度不夠,球與球之間發生粘連;而過多的乳化劑則會造成一定程度的氣泡,影響微球的均勻性。
此外攪拌速度和成球之后的半徑成反比,這是因為在更大轉速下,更高的剪切力的作用下乳滴會形成更小的顆粒。
Step 4. 固化成球
逐漸降低溫度(建議1-2℃/min),降低到室溫后瓊脂糖微球基本就成型了。加入去離子水并靜置2小時以上,對微球進行洗滌去除有機相,得到未交聯的瓊脂糖微球。
如果固化時間過短,則會導致微粒粒徑分布過大,也會有較多的顆粒聚集在一起,形成較大顆粒,是平均粒徑偏大。
Step 5. 進行交聯
微球可以在堿性條件下與交聯劑反應,常用的交聯劑有環氧氯丙烷等短鏈交聯劑、丙二醇縮水甘油醚等長鏈交聯劑,也可以分別用短鏈、長鏈交聯劑進行交聯,一般先采用長鏈交聯劑,再用短鏈交聯劑,這樣得到的瓊脂糖微球機械性能會更好。
一般交聯步驟如下:例如每100g瓊脂糖脫水微球,加入到100 ml 1M氫氧化鈉,再加入2ml環氧氯丙烷,2g硼氫化鈉室溫下攪拌一小時,再加熱到60度攪拌一小時,后用冷水清洗備用。
在一定范圍內的增加交聯時間,瓊脂糖微球的孔隙率得到一定程度的提升;當然不同分子量的瓊脂糖形成的微球孔徑也會有所不同,一般來說,大分子量的形成的孔會更小。
瓊脂糖微表面帶有負電荷,可能會對后續的層析分離,造成一定程度的影響,在表面修飾進行改善。
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