PCR技術是什么

一、PCR是什么

聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。

PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

二、PCR原理

基本反應原理

從專業(yè)的角度來說，PCR 由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

1模板 DNA 的變性：模板 DNA 經加熱至 94℃ 左右一定時間后，使模板 DNA 雙鏈或經 PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；

2模板 DNA 與引物的退火 （復性）：模板 DNA 經加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結合；

3引物的延伸：DNA 模板--引物結合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、PCR的基本反應步驟

1.引物的設計：

引物需要自己查找文獻或者自己設計，然后交給合適的生物公司來幫我們合成，合成引物，每管裝1OD。拿到引物后需要加水溶解，但是因為引物是看不見的，所以為了防止溶解過程中引物的丟失，拿到引物后最好先高速離心（10000rpm, 4°C離心2min）再進行加水溶解（ddH2O）。水的體積按引物濃度稀釋100倍，溶解好的引物用小管分裝，每管裝50μl即可，分裝后放-20°C保存。

2.制作模板：

模板的制作可以直接借助試劑盒，一般情況下Trizol的試劑可以完全滿足需要，直接按照試劑盒提示來做就可以了。

3.建立體系、上機：

PCR需要用到的DNA聚合酶、buffer、dNTPs。而經常用的DNA聚合酶有Taq酶，買的同時會附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些還有(NH4)2SO4)。做PCR之前要提醒大家一點，不是所有的PCR都用同樣的反應體系的，也就是說PCR體系里用到的試劑除了10×Taq Buffer以外，其它其實都是需要摸條件的，但是按大多數情況來說，需要調整的并不多，可能需要調整的主要試劑是MgCl2（其實是要調整Mg2+的濃度）；可能需要控制的條件主要是退火溫度。

4.跑膠驗證：

在電泳之前，需要進行凝膠的配制，凝膠液配制的過程并不復雜，先用天平稱取適量的瓊脂糖粉末，加入到一定體積的1×TAE（Tris、乙酸、EDTA）緩沖液中，微波爐加熱至沸騰，拿出來搖勻，幫助粉末溶解，反復沸騰多次直到粉末完全溶解。待溶液不燙手，將核酸染料加入溶液中搖勻，接著將溶液趁熱倒到做膠的凝膠板上，插上梳子（用來預留加樣孔），等半小時左右膠凝固拔下梳子，連膠帶板一起放到電泳槽中，加電泳液至完全淹沒整塊凝膠（電泳槽中的電泳液也用1×TAE緩沖液）。然后將loading buffer與樣品混合，加入到凝膠小空（“梳子”形成的洞）中，DNA maker作為對照，同樣加入到篩孔中，然后插上電源開始跑膠就可以了，凝膠上有顏色的有兩條帶，等到前面的藍色帶跑到整塊膠的2/3處停止電泳（斷電），然后把膠拿出來，放到紫外光下觀察條帶。