細胞融合實驗怎么做？

一、實驗原理

根據Burnet的抗體選擇學說，一個B淋巴細胞只能產生一種針對它能夠識別的特異性抗原決定簇的抗體。從一個祖先B細胞分裂繁殖而形成的純細胞系稱為克隆。來自克隆系的細胞基因是完全相同的，產生的抗體也完全相同。這種從一株克隆系產生的性質相同的均一抗體稱為單克隆抗體。但這種具有分泌功能的B淋巴細胞難以在體外長期存活。

利用細胞融合技術，將上述B淋巴細胞與在體外能長期增殖的骨髓瘤細胞進行融合，經過選擇培養(yǎng)獲取雜交細胞，這種細胞稱為雜交瘤細胞（Hybridoma）。該細胞既有免疫B淋巴細胞分泌特異性mAb的功能，又具有骨髓瘤細胞無限增殖的能力。故應用雜交瘤細胞生產單克隆抗體。

二、儀器設備材料

超凈工作臺、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、倒置生物顯微鏡、離心機、恒溫水浴箱、冰箱、細胞混勻器、熒光顯微鏡或流式細胞儀等。培養(yǎng)器皿及其它：96孔、24孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、離心管、平皿、保溫杯、培養(yǎng)液過濾裝置、不銹鋼網及手術剪刀、鑷子等。Balb/c小鼠。SP2/0細胞（骨髓瘤細胞）。

三、主要試劑

（1）胎牛血清或小牛血清

（2）培養(yǎng)基：細胞融合常用的培養(yǎng)液有DMEM、RPMI 1640 及無血清培養(yǎng)基等。DMEM有高糖（4500mg／L）及低糖（1000mg／L）之分。雜交瘤細胞在上述幾種培養(yǎng)基中均能良好的生長與增殖

（3）HAT及HT培養(yǎng)液：HAT、HT（sigma）以五十分之一的比例加入培養(yǎng)基（ DMEM或RPMI 1640）

（４）聚乙二醇（PEG）溶液：稱取一定量的PEG，高壓蒸汽滅菌（8磅30分鐘），待其冷至50℃左右，與等體積的RPMI1640混合，即為50%的PEG溶液，封口后4℃放置備用。用于細胞融合的PEG的分子量可在1000－6000之間，目前已有商品化的50%PEG溶液（美國 sigma 公司）可直接用于細胞融合

四、實驗步驟

1. DMEM或1640基礎培養(yǎng)基、PEG溶液置于37℃水浴中預溫；

2. 將Balb/c小鼠摘眼球處死后，浸入75%灑精；

3. 無菌取免疫小鼠的脾臟；

4. 脾臟用PBS洗滌后，放入無菌過濾的網篩，再把網篩放在盛有完全培養(yǎng)基的玻璃平皿中用研磨棒（或注射器針管）輕輕研磨或擠壓，使其通過網篩；

5. 將培養(yǎng)皿中的細胞懸液吸出，放入離心管中，1200rpm/min，離心5min；

6. 收集2×10^7個生長良好的SP2/0細胞，與1×10^8個脾臟細胞混合于透明塑料離心管中；

7. 用RPMI1640洗滌混合細胞兩遍，1000rpm離心8min后，棄盡上清并用手指彈擊管底，使兩種細胞充分混勻成糊狀；

8. 將塑料管置于37℃保溫杯中，吸取1ml經37℃預溫的50%的PEG溶液，將吸管輕輕插入細胞底部，在1min內勻速加完，且邊加邊輕輕攪拌；

9. 在水浴中靜置90s，再加入40ml 37℃預溫的DMEM基礎培養(yǎng)基，室溫靜止5min后離心（1000rpm×10min），棄去上清；

10. 將沉淀細胞輕輕用40ml含1%HAT、15%FCS的DMEM培養(yǎng)懸浮?；靹蚝蟮渭釉谏鲜龊凶甜B(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，100µl/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

11. 3~4d后半量換液，10d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，2周后轉用含15%FCS（胎牛血清）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

12. 培養(yǎng)結束后，顯微鏡觀察融合細胞。

五、注意事項

1、整個制備過程需嚴格無菌及溫度控制。

2、細胞傳代培養(yǎng)時注意適時更換培養(yǎng)液。

3、SP2/0細胞與脾細胞比例需嚴格控制，這決定了融合率。

4、融合細胞因細胞膜受損而特別脆弱，操作過程需溫和小心。

5、融合劑PEG的加入時間需準確把握，避免融合失敗。

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