根據(jù)免疫識(shí)別和信號(hào)輸出方式的不同,ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法和非直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法等等,其中雙抗夾心法最為常見(jiàn)。
雙抗體夾心法:
①:抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙/烯制成,其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力,結(jié)合靜電和疏水作用,可以將抗體吸附于其表面。然后,將未吸附的抗體用緩沖液清洗后,加入含有明膠或牛血清蛋白的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的,是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上,造成假陽(yáng)性信號(hào),干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
②:免疫識(shí)別 在96孔板上包被抗體后,加入待測(cè)樣,并在37°C環(huán)境下孵育一段時(shí)間,通常是1-2小時(shí)。此時(shí)酶標(biāo)板上的抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵,好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測(cè)樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等成分的影響。
③:洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉,加入該抗原所對(duì)應(yīng)的識(shí)別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí),接著將未連接上抗原的抗體洗掉。
④:酶標(biāo)信號(hào)輸出 加入帶有辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的酶標(biāo)二抗,用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗,并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為,抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。
以抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體為例,在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測(cè)抗原后,立刻加入酶標(biāo)抗原,使之與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測(cè)抗原濃度越高,能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少,輸出的信號(hào)就越少。這樣待測(cè)樣濃度與酶顯色信號(hào)就呈逆相關(guān)。
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