ELISA空白背景高的原因和處理方法

1）洗板不干凈

解決方法：

①充分洗滌：如果洗板的時間不夠，會導致抗體殘留，陰性對照會顯色，嘗試延長洗板時間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20。

在洗板時要保證每步都洗滌完全，充分拍板直至孔內沒有明顯的殘留液體。

②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時避免交叉污染，移液槍頭盡可能一次性使用，拍板的濾紙不要反復使用。

2）顯色液變質或者試劑過期

解決方法：檢查試劑盒有效期，或使用新的試劑盒并按照說明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。

3）試劑稀釋有誤，檢測抗體/酶結合物工作液濃度過高

解決方法：按照說明書推薦的稀釋倍數稀釋抗體。

4）試劑盒組分未平衡

解決方法：試劑盒每個組分都需要平衡至室溫后進行實驗。

5）混用其他試劑盒試劑

解決方法：保證使用試劑盒內完整的一套試劑進行實驗，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現象，不同批號的試劑不要混用。

6）蒸餾水受酶等污染

解決方法：使用新鮮蒸餾水。

7）培養箱溫度超過37℃或反應時間過長

解決方法：孵育時間過長、溫度過高可能會導致非特異性結合增加，從而造成本底增高。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩定在37℃，按照說明書的反應時間進行孵育。

8）酶標板底部有污漬

解決方法：在加完終止液之后，檢測之前，用75%乙醇浸潤的脫脂棉球擦拭酶標板底部，確認沒有污漬之后再檢測。

9）洗液被污染

解決方法：洗液現配現用，長期放置會析出，也可能會污染，導致背景偏高。

10）包被的抗原被污染

解決辦法：仔細回想操作過程，換新的抗原包被。

11）封閉液、封閉時間、封閉液的濃度

解決辦法：封閉液（BSA）可能會與抗體產生交叉反應。封閉液的濃度偏低、封閉時間過短導致封閉不徹底，抗體與酶標板結合，可能也會導致背景偏高，因此可以適當調整封閉液的濃度和時間以降低背景。

12）抗體質量差或選擇的抗體不合適

解決辦法：抗體質量不高，特異性不好可能會與封閉液（BSA）產生交叉反應，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替。

若選擇多克隆抗體孵育，可能會與酶標單抗產生交叉反應，導致背景增加，最好選用與酶標單抗同種屬的多克隆抗體。

13）酶標儀設置參數有誤

解決辦法：檢查酶標儀設置的波長，不同波長下樣品的吸光光度值也會有很大的差別，按照說明書要求設置參數。

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