RNA提取原理與詳細步驟

原理

用Trizol 的溶液提取，將總RNA與 DNA 和蛋白質分離。Trizol 是一種酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白質和 RNase 變性。隨后進行離心。在酸性條件下，總 RNA 保留在上層水相中，而大部分 DNA 和蛋白質保留在中間相或下層有機相中。然后通過用異丙醇沉淀回收總 RNA。RNase 酶可以通過加入吡咯碳酸二乙酯 (DEPC) 來滅活。

步驟

組織：每 100 毫克新鮮組織加入 1 毫升 TRIzol 試劑，使用無菌手術刀在冰上切碎，并用無菌勻漿器或其他設備勻漿。

細胞：如果是細胞培養物，應在從培養箱中取出后立即進行處理。細胞在室溫（15-25 ºC）下以 1000rpm 離心5 分鐘，然后丟棄上清液或從單層生長的細胞中去除培養基，用預冷PBS洗一次。每 1 × 10<7> 細胞加入 1 ml TRIzol 試劑。

1. 4°C 預冷離心機

2. 將組織或細胞裂解液轉移到 1.5毫升無RNA酶EP管中。置冰上，靜置 5 分鐘。

3. 每管加入200ul氯仿，充分混合后冰上靜置10分鐘，使核蛋白復合物完全解離。

4. 在 4°C 下以 13000 rpm離心 15 分鐘。期間，取一新EP管，加入500ul異丙醇，冰上預冷。

5. 離心后，將上層水相 (約500 ul) 轉移到該新的 EP管中。

6. 冰上靜置，酒精沉淀10min。

7. 離心， 13000 rpm， 10 分鐘。

8. 去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀一次。

9. 12000rpm離心 5 分鐘。

10. 去掉上清，風干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分鐘。

11. 將 RNA 溶解在30-50ul DEPC 處理過的去離子水中（需根據RNA沉淀的量加水溶解）。

12. 進行分光光度分析以確定樣品濃度和純度。

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