免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

基本原理：免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。

1.1組織標(biāo)本的處理

1）將組織塊大小約為（1×1×1cm）的組織樣本放入10%的中性福爾馬林溶液中，等固定48h后，將組織取出對組織面進(jìn)行修整并放入包埋盒中

2）利用自動(dòng)脫水機(jī)對包埋好的組織樣本進(jìn)行脫水處理

3）取出已經(jīng)脫水完的組織，將組織外圍的石蠟溶解，將脫蠟的組織塊以最大切面朝下放入鉛制模具中，加入石蠟將組織完全包埋，蓋上底板，置于冰上冷卻，放入-4℃冰箱

4）調(diào)整切片機(jī)，對石蠟包埋的組織進(jìn)行修片

5）將切片厚度設(shè)置為3μm/片，進(jìn)行切片，右手連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)操作桿待出現(xiàn)3-4個(gè)折疊蠟片后，用左手持毛筆，筆尖輕觸完整蠟片下沿，慢慢的向后引導(dǎo)和拉伸蠟片，并且右手同時(shí)進(jìn)行連續(xù)切片，盡量協(xié)調(diào)左右手使得蠟片連續(xù)不中斷

6）直至所需蠟片長度后，用右手持鑷子輕輕夾到蠟片尾端，緩慢的將蠟片由遠(yuǎn)端向近端平鋪于攤片機(jī)后，在連接處分段，進(jìn)行攤片和撈片（攤片機(jī)溫度設(shè)置）

7）撈好的片子置于玻片架上，保存于4℃冰箱

1.2 免疫組織化學(xué)染色

1.2.1 脫蠟、水化（組織脫水的目的是通過酒精的媒介讓有機(jī)溶劑滲透入組織，再讓石蠟置換有機(jī)溶劑，從而使組織包埋在石蠟中。水化是組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，用酒精洗去二甲苯，所以必須從高濃度酒精開始，然后再利用酒精的媒介入水。）

1）將4℃保存的切片取出，轉(zhuǎn)移至金屬切片架中，放入70℃恒溫烤箱中，烤片90min（使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固貼在玻片上。）

2）烤片結(jié)束后，立即將切片放入二甲苯I脫蠟10min

3）轉(zhuǎn)移至二甲苯II脫蠟10min

4）過梯度酒精（100%-95%-80%）各5min

5）在裝有自來水的缸中洗三遍，每次洗完后換上新的自來水

6）在純水中洗滌，上下涮洗15次，每次洗滌完換水重復(fù)3次，洗滌完后轉(zhuǎn)移至3%H2O2中浸泡10min，再過3次純水（內(nèi)源性過氧化物酶會(huì)與基質(zhì)溶液（過氧化氫和顯色劑，例如DAB）發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性。在與HRP偶聯(lián)抗體一起孵育之前，先用過氧化氫預(yù)處理樣本可以顯著降低這種非特異性背景。有效降低內(nèi)源性過氧化物酶導(dǎo)致的非特異性染色）背景性太強(qiáng)：原因一

1.2.2 抗原修復(fù)（組織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉）

7）將切片放于裝有0.01M檸檬酸緩沖液（pH6.0±0.1）的高壓鍋中，進(jìn)行高壓修復(fù)2.5min，然后轉(zhuǎn)移到冷水中冷卻（自然冷卻？？溫度劇降可能引起脫片，同時(shí)高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其他的束縛或聯(lián)結(jié)，會(huì)慢慢地恢復(fù)原來的形態(tài)和構(gòu)型）（修復(fù)時(shí)間過長可能會(huì)使染色背景加深，緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。）

8）等待冷卻期間配PBS液1：1000（純水）

9）稀釋抗體（一抗）（背景性太強(qiáng)：原因二，一抗?jié)舛冗^高，一抗與非靶向的抗原表位的非特異性結(jié)合，降低一抗?jié)舛然蛘咴黾臃忾]液濃度）（目標(biāo)蛋白的結(jié)合太弱：一抗上的抗原決定簇與細(xì)胞上靶抗原的親和力很弱，可能因?yàn)榻M織切片長期保存而使其蛋白降解或變性。）

10）過3次純水（上下涮洗15次），然后用PBS洗滌3次（每次5min)

1.2.3 孵育抗體

11）血清封閉：將切片放入準(zhǔn)備好的于一抗具有相同種源的血清中，室溫封閉15-30min。封閉完后傾去封閉液

12）將稀釋好的一抗滴加在切片組織之上，將切片置于4℃過夜孵育一抗。孵育完后，回收一抗，然后用PBS沖洗，3min×5次

13）滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30min至1h，PBS沖洗，3min×5次（背景性太強(qiáng)：原因三，二抗與細(xì)胞上類似的抗原表位具有強(qiáng)的親和力而非特異性結(jié)合，如果封閉血清跟二抗來自同一種屬，那么稍微增大血清濃度至2%以上。如果用BSA或脫脂奶粉封閉，那么就可用與二抗同一種屬的血清。）

14）DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度

15）自來水充分沖洗10min

1.2.4 復(fù)染（目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，蘇木素復(fù)染（胞核染料）細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木素精堿性染料以離子或氫鍵結(jié)合而被染色，蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色

16）蘇木素染色：蘇木素染液染15s，如果染色液用了多次在使用前必須除去染色液中的金色雜質(zhì)

17）自來水洗片至水轉(zhuǎn)清

18）用1%鹽酸分化，一般處理3s左右，具體處理時(shí)間根據(jù)染色的深淺，處理完后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色的程度（蘇木素染色之后，用水洗去未結(jié)合在細(xì)胞上的染液，但是在細(xì)胞核中結(jié)合過多的染料和細(xì)胞漿中吸附的染料必須用分化液1%鹽酸酒精脫去，才能保證細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色的分明）因酸能破壞蘇木素的醌型結(jié)構(gòu)，使色素與組織解離，分化不可過度

19）用自來水沖洗4-5次

20）放入碳酸鋰（返藍(lán)液）中反藍(lán)處理2s（分化之后蘇木素在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)，而呈藍(lán)色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱堿性水使蘇木精染上的細(xì)胞核變呈藍(lán)色，稱藍(lán)化作用）

21）反藍(lán)后放回水中繼續(xù)洗15min。

1.2.5脫水，封片

22）置于85%酒精中5min，95%酒精中5min，100%酒精中5min

23）二甲苯兩缸各10min

24）于通風(fēng)櫥中風(fēng)干二甲苯

25）中性樹膠封片